Penelope urodziła się pod Madrytem w zwykłej robotniczej rodzinie. Jej mam była fryzjerką, a tata mechanikiem samochodowym. Jako młoda dziewczyna chciała zostać tancerką i przez kilka lat uczyła się w szkole baletowej. Swoją aktorską karierę zaczynała w szkole średniej, grając w teledyskach i niskobudżetowych serialach.
Na wielkim ekranie zadebiutowała w 1991 roku w filmie "El Laberiento" Griego Rafaela Alcazara. W 1999 roku wystąpiła w filmie Pedro Almodóvara "Wszystko o mojej matce". Film ten został nagrodzony Oscarem dla najlepszego filmu obcojęzycznego.
Wielki kinowy sukces odniósł kolejny film z Cruz "Vanilla Sky". Na planie rozkwitł romans między Penelope a Tomem Cruise'em, który rzucił dla niej ówczesną żoną Nicole Kidman. Ich związek przetrwał trzy lata.
W 2005 roku na planie Sahary zakochała się w Matthew McConaughey'u, z którym miała trwający rok romans.
Na swojego Oscara aktorka musiała czekać do 2009 roku. Statuetkę dostała za rolę w filmie Woody'ego Allena "Vicky Cristina Barcelona".
Penelope od 2010 roku jest żoną aktora Javiera Bardema. Mają razem dwójkę dzieci: syna Leo i córeczkę Lunę.